同济医院的研究团队利用小鼠双侧缺血再灌注（I-R）模型来诱导肾损伤和随后的肾纤维化。通过荧光原位杂交技术和免疫荧光染色技术，发现NRP1在远端肾小管上皮细胞中的表达与肾脏疾病进展密切相关（图1）。

图1. 移植肾功能不全患者和小鼠IR诱导的AKI和CKD中远端肾小管上皮细胞（TECs）中NRP1表达上调

A）IR手术后肾脏中Tgfbr1的表达水平。

B）IR手术后肾脏中NRP1的表达水平。

C）IR手术后肾脏中NRP1的表达水平。

D）使用荧光原位杂交（FISH）对NRP1和Cdh16进行共染色。

E）IR（假手术组n=7；IRD1组n=7；IRD5组n=8；IRD14组n=8）、UUO（假手术组n=7；UUOD7组n=8）和5/6肾切除术（每组n=8）小鼠中NRP1的代表性免疫荧光图像。

F）UMAP图显示了远端肾小管（DT）细胞的分布，包括髓袢（LOH）、远端卷曲小管（DCT）、集合管主细胞（CD-PC）和集合管插入细胞（CD-IC）。

G,H）DT细胞中NRP1与TGF-β受体的共表达。

I）使用STRING网站（https://string-db.org/）构建的NRP1、TGF-β、TNF-α及其受体之间的相互作用关系。

J）DT细胞中Tnfr1的表达水平。

K）NRP1与Tnr1a相互作用的免疫沉淀实验。

L）DT细胞中NRP1与TNF-α受体的共表达。

M）使用免疫荧光染色共表达NRP1与Tgfr1、Tnr1a和远端肾小管标志物S12a3。实验独立重复3次。

N）肾移植患者的肾脏中NRP1的免疫荧光染色。

NRP1与TNF-α受体和TGF-β受体相互作用，通过影响细胞能量代谢和激活SMAD3通路，导致线粒体功能受损、细胞死亡、胶原蛋白分泌增加和肌成纤维细胞激活，从而加速肾脏疾病的进展。简言之，在病变肾脏中，远端肾小管中NRP1的表达上调。NRP1与TGF-β和TNF-α的相互作用表明它可能在急性损伤和肾脏疾病的慢性进展中发挥潜在作用。

临床研究显示，NRP1是接受肾脏移植后出现肾功能障碍患者肾功能下降的独立危险因素，针对NRP1的干预可能成为慢性肾脏疾病的一种有前景的治疗策略（表1）。

表1. 肾移植功能障碍患者肾功能下降的相关危险因素

研究团队进一步发现，通过阻断NRP1和TGF-β的相互作用，可以显著改善肾损伤和纤维化（图2-3）。这一发现为临床治疗AKI和CKD提供了新的治疗靶点，为患者带来了新的希望。

图2. TECs中NRP1的敲除减少了I-R诱导的肾脏损伤和纤维化

A）通过RT-qPCR测量的NRP1水平（假手术组n=7；Vehi+IRD5组n=6；Tmx+IRD5组n=7）。

B）I-R分析实验方案的示意图。

C）小鼠肾脏重量与体重之比。假手术组、Vehi+IR组或Tmx+IR组在术后5天（假手术组n=8；Vehi+IRD5组n=7；Tmx+IRD5组n=7）和14天（每组n=7）的血浆尿素氮（BUN）浓度和肌酐（CR）浓度。

D）小鼠在IR后第5天的过碘酸雪夫（PAS）染色代表性显微照片及相应统计评分、Kim1免疫荧光染色代表性显微照片及相应统计评分，以及通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测的血浆Kim1（假手术组n=8；Vehi+IRD5组n=7；Tmx+IRD5组n=7）。肾小管损伤评估涉及评价肾小管坏死、管型形成、肾小管扩张和刷状缘丢失。根据损伤程度分配评分：0表示无损伤，1表示10%损伤，2表示11-25%损伤，3表示26-45%损伤，4表示46-75%损伤，5表示超过76%损伤。

E）小鼠在IR后第14天的PAS染色、Masson染色、天狼星红染色、Kim1免疫荧光染色代表性显微照片及相应统计评分，以及通过ELISA检测的血浆Kim1（每组n=7）。

F）使用RT-qPCR在IR后第14天测定的肾脏损伤指标（Havcr1和Lcn2）和纤维化相关因子（Acta2、Pdgfrb、Col1a1和Fn1）的表达水平（每组n=5）。

图3. NRP1上调Nfkb1和Smad3通路，抑制Etv6和Acox3的表达，导致TECs中的OXPHOS和TCA水平降低

A）DT细胞的转录因子活性分析热图。

B）蛋白质印迹分析显示IR和NRP1敲除后Nfkb1、Smad3、α-SMA和Pdgfrb的变化（每组n=3）。

C）DT细胞中Tnfa、Nfkb1和Smad3的点图。

D）T-SNE图显示DT细胞中NRP1的表达区域和Nfkb1及Etv6的转录因子活性区域。

E）使用qPCR检测与抗Nfkb1单克隆抗体结合后Etv6的扩增水平（每组n=3）。

F）肾脏中巴豆酰辅酶A（crotonyl-CoA）生成酶的点图。

G）生成克罗托酰辅酶A所涉及的酶的示意图。

H）蛋白质印迹分析显示IR和NRP1敲除后克罗托酰化赖氨酸修饰的变化。

I）热图展示了在IR处理前后以及NRP1敲除前后，具有变化的克罗托酰化修饰位点的蛋白质所富集的京都基因与基因组百科全书（KEGG）途径。

J）单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据中，与NRP1-DT细胞相比，NRP1+DT细胞下调的KEGG途径。统计分析为双侧，并对P值进行了调整。

K）DT细胞中与线粒体功能状态相关基因的点图。

L）使用TNF-α和Tmx处理的原代肾小管上皮细胞（pTECs）中MitoTracker的免疫荧光染色。

M）能量图显示NRP1敲除后pTECs的耗氧率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）增加（每组n=5）。数据代表3次独立实验的结果。

总之，这项研究强调了NRP1在肾病进展中的重要作用（图4）。在远端肾小管上皮细胞中，NRP1与TGF-β和TNF-α受体相互作用，同时激活Nfkb1和Smad3通路，调节胶原蛋白的分泌，抑制氧化磷酸化（OXPHOS），激活肌成纤维细胞，从而加速急性和慢性肾脏疾病的进展。在远端肾小管中阻断NRP1和TGF-β受体可显著改善肾损伤和肾纤维化，这为治疗AKI及其向CKD的进展提供了治疗靶点。

图4. 阐明NRP1促进肾脏损伤和纤维化的机制的示意图